Aula 11 - Tecnologia do DNA Recombinante

Aula 11 - Tecnologia do DNA Recombinante

Objetivo Geral:

Apresentar as ferramentas para o desenvolvimento de um plasmídeo de expressão.

Objetivos específicos:

1. identificar uma proteína de interesse e encontrar sua sequência no banco de dados UNIPROT
2. realizar as etapas de preparo da sequência de nucleotídeos para síntese química

Passo a passo

• Escolha a proteína de interesse (Ex: Proteína que da a cor azul aos olhos)
  • Utilize banco de dados de patentes e artigos para encontrar a proteína de interesse
    • Pubmed
    • Google Acadêmico

• Encontre a proteína no banco de dados do UNIPROT
  • A busca pode ser feita com o códido da proteína, se conhecido, ou buscando por sua função ou processo em que está envolvida.~
    • Ex: Proteína SHH (Sonic Hedgehog - "Sonic o Porco espinho")
    • Leia as informações sobre a proteína

• Busque o arquivo FASTA
  • Ex: Arquivo FASTA da SHH

>sp|Q62226|SHH_MOUSE Sonic hedgehog protein OS=Mus musculus GN=Shh PE=1 SV=2

MLLLLARCFLVILASSLLVCPGLACGPGRGFGKRRHPKKLTPLAYKQFIPNVAEKTLGAS GRYEGKITRNSERFKELTPNYNPDIIFKDEENTGADRLMTQRCKDKLNALAISVMNQWPG VKLRVTEGWDEDGHHSEESLHYEGRAVDITTSDRDRSKYGMLARLAVEAGFDWVYYESKA HIHCSVKAENSVAAKSGGCFPGSATVHLEQGGTKLVKDLRPGDRVLAADDQGRLLYSDFL TFLDRDEGAKKVFYVIETLEPRERLLLTAAHLLFVAPHNDSGPTPGPSALFASRVRPGQR VYVVAERGGDRRLLPAAVHSVTLREEEAGAYAPLTAHGTILINRVLASCYAVIEEHSWAH RAFAPFRLAHALLAALAPARTDGGGGGSIPAAQSATEARGAEPTAGIHWYSQLLYHIGTW LLDSETMHPLGMAVKSS

• Utilize algum software para gerar a sequência de nucleotídeos, otimizando os códons para o sistema de expressão desejado

• • Ex: IDT CodonOpt
    • Adicione a sequência de aminoácidos na caixa em branco. Selecione a opção aminoácidos e tipo de produto (Tanto faz para fins de aprendizado)
    • Escolha o organismo ao qual quer se otimizar os códons e clique em "Optmize"

Uma possível sequência obtida com o exemplo seria: >sp Q62226 Opt E. coli

ATG CTT TTA TTG CTG GCA CGT TGC TTC CTT GTT ATT CTT GCG AGC TCT TTA CTG GTA TGC CCG GGA TTA GCG TGT GGA CCA GGG CGT GGC TTC GGG AAG CGT CGC CAC CCC AAG AAA CTG ACT CCC TTG GCT TAC AAA CAG TTT ATC CCC AAC GTG GCC GAG AAA ACT TTG GGT GCT AGT GGC CGT TAC GAG GGG AAG ATC ACC CGT AAC TCC GAG CGT TTC AAA GAA CTT ACG CCG AAT TAC AAC CCT GAC ATC ATC TTT AAG GAC GAG GAA AAT ACA GGA GCG GAT CGC TTG ATG ACC CAG CGT TGC AAA GAC AAG CTG AAT GCC CTT GCA ATT AGC GTA ATG AAT CAG TGG CCG GGG GTG AAG TTG CGC GTG ACC GAG GGT TGG GAT GAG GAT GGT CAT CAT AGT GAG GAA TCC CTG CAC TAC GAA GGG CGT GCG GTC GAC ATC ACG ACA AGT GAC CGC GAT CGT TCA AAA TAT GGA ATG CTT GCG CGT CTG GCC GTC GAA GCA GGT TTC GAC TGG GTA TAT TAT GAA TCT AAG GCT CAC ATC CAC TGC AGT GTG AAG GCC GAG AAT TCG GTA GCT GCG AAA TCC GGG GGT TGT TTT CCT GGA TCG GCC ACT GTA CAC CTT GAG CAA GGC GGA ACT AAA CTG GTA AAA GAC TTA CGC CCC GGT GAT CGT GTG CTT GCG GCT GAC GAT CAA GGG CGC CTG TTA TAT TCT GAT TTC TTG ACG TTC TTA GAC CGC GAC GAA GGA GCG AAA AAG GTG TTC TAT GTC ATC GAA ACG CTG GAG CCC CGT GAA CGT TTA TTA TTA ACG GCG GCG CAT CTT CTG TTC GTC GCT CCG CAT AAC GAC AGT GGT CCA ACC CCT GGT CCC TCT GCA TTA TTC GCC TCG CGT GTA CGT CCA GGA CAA CGC GTG TAC GTT GTG GCG GAG CGC GGC GGG GAC CGT CGC CTT TTG CCT GCC GCG GTA CAT TCC GTT ACA CTT CGT GAA GAG GAG GCG GGG GCT TAT GCA CCA CTG ACG GCA CAC GGA ACC ATC TTA ATC AAT CGT GTC TTG GCA TCT TGC TAT GCC GTC ATT GAG GAG CAT TCC TGG GCA CAT CGC GCT TTT GCT CCA TTT CGT TTG GCG CAC GCC TTA CTT GCA GCA TTG GCT CCG GCG CGT ACG GAC GGG GGA GGA GGA GGC TCC ATT CCG GCT GCG CAG TCT GCA ACT GAG GCT CGC GGT GCG GAG CCA ACA GCG GGC ATC CAC TGG TAT TCA CAA TTG CTG TAT CAT ATT GGA ACG TGG CTG TTG GAT TCC GAG ACC ATG CAT CCC CTT GGC ATG GCT GTA AAG TCA TCG

• Adição de Tag de purificação (Não é obrigatório, depende do propósito do projeto). Influência na estratégia de purificação e identificação da proteína por western blot. Além da quantificação por ELISA
  • Lista de Tags
  • Escolha o Tag desejado e códon otimize ele, da mesma maneira que a sequência anterior
    • Ex: Strep-tag II (WSHPQFEK)
      • Códon otimizado para E. coli TGG TCT CAC CCT CAA TTT GAG AAG

• É preciso definir a estratégia de clonagem e expressão
  • Ex: Utilizando plasmídeo (Vetor de expressão) para produção em E. coli
    • Ex: pALTER-EX1
    • Definir sítios de restrição a serem utilizados
      • Ex: XbaI - TCTAGA, BamHI - GGATCC
      • Adicionar sítios flanqueando a sequência de interesse, observando a posição do promotor e do start codon da sequência, no exemplo, XbaI tem que ficar em 5' e BamHI em 3'.

TCT AGA ATG CTT TTA TTG CTG GCA CGT TGC... ... CCC CTT GGC ATG GCT GTA AAG TCA TCG GGA TCC

• Fazer o pedido
• Receber a sequência e realizar as técnicas de clonagem utilizando as enzimas escolhidas.